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　　摘 要：采用雙三元液相色譜(Dual gradient liquid chromatography,DGLC)建立了在線固相萃取技術(shù)與電噴霧 串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法(Online SPE DGLC鄄ESI MS / MS),并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)。 本方法同時(shí)檢測(cè)大豆不同 部位中的 4 種酸堿性植物激素(赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)和脫落酸(ABA))。 通過(guò)考察固 相萃取富集柱、分析色譜柱、流動(dòng)相對(duì)植物激素的保留和選擇性的影響,獲得較高的靈敏度、回收率、穩(wěn)定性及精 密度。 大豆樣品經(jīng)液氮低溫研磨,以 80% 甲醇溶液提取,再經(jīng)離心稀釋過(guò)濾后,進(jìn)樣分析。 進(jìn)樣后樣品經(jīng)在線 固相萃取 Hypersep Retain AX 柱洗脫保留,目標(biāo)分析物依次轉(zhuǎn)移至分析柱 Acclaim PA2 色譜柱,并以 0. 1% 甲酸 和甲醇溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子模式(SRM)同時(shí)采集正負(fù)離子通道進(jìn)行定性分 析,基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量分析,GA3, IAA, ZT 在 0. 1 ~ 50 滋g / L 范圍內(nèi)線性良好,檢出限為 0. 0002 滋g / g; ABA 在 0. 5 ~ 50 滋g / L 的范圍內(nèi)線性良好,其檢出限為0. 0010 滋g / g。 以 0. 8, 4. 0 和 40 滋g / L 分別 為低、中、高濃度考察 4 種植物激素的回收率為 76. 1% ~ 93. 5% ,RSD 為 0. 8% ~ 6. 0% 。 結(jié)果表明,籽粒中含有 的 ABA 濃度明顯高于其它部位。 本研究為快速準(zhǔn)確地分離和測(cè)定大豆不同部位內(nèi)源激素提供了有效方法。
 

　　1 引 言 ：赤霉素(GA3 )、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)和脫落酸(ABA)是 4 種重要的植物內(nèi)源激素,廣泛分 布在植物體內(nèi),對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、分裂、器官建成、植物的休眠萌發(fā)形態(tài)反應(yīng)等都有直接或間接 的調(diào)節(jié)控制作用,參與植物生命的所有活動(dòng)[1 ~ 3] 。 但是,內(nèi)源激素因其在植物中的含量極低,基質(zhì)干擾 多,使得農(nóng)作物內(nèi)源激素的測(cè)定十分困難,因此痕量激素的測(cè)定技術(shù)已成為制約植物激素學(xué)界研究的 大瓶頸之一,同時(shí)也是分析科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4] 。 目前,關(guān)于農(nóng)作物中內(nèi)源激素測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道多結(jié)合液相色譜技術(shù)或液相色譜鄄質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),進(jìn) 樣前幾乎均采用固相萃取(SPE)技術(shù)去除農(nóng)作物中復(fù)雜基質(zhì)干擾。 顯然,固相萃取技術(shù)在復(fù)雜基體中 痕量組分分析中處于核心地位,是農(nóng)作物內(nèi)源激素測(cè)定較為理想的選擇[5,6] 。 已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道表明, 其所采用的固相萃取方法處理過(guò)程基本上還處在手工操作階段,存在過(guò)程復(fù)雜、耗材消耗量大、有毒試 劑接觸多、需要額外氮吹、重現(xiàn)性差、無(wú)法實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)聯(lián)機(jī)和通量低等問(wèn)題。 本實(shí)驗(yàn)所采用的在線固相 萃取技術(shù)是一種全自動(dòng)的在線樣品前處理方式,是近年來(lái)商品化的儀器樣品前處理新技術(shù)。 在線聯(lián)接 可避免因復(fù)雜前處理過(guò)程而帶來(lái)的分析物損失,減少操作者因溶劑揮發(fā)與有毒溶劑的接觸,節(jié)省時(shí)間, 提高效率、可靠性和靈敏度,在線固相萃取分析越來(lái)越受到人們的重視[7,8] 。 目前,在線固相萃取技術(shù) 在農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用并不多見(jiàn),因此本方法較已發(fā)表的關(guān)于測(cè)定植物激素的方法[9,10] 具有前處理簡(jiǎn) 便、實(shí)驗(yàn)快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。 植物激素包括生長(zhǎng)素(Auxins)、赤霉素(Gibberellins)、細(xì)胞分裂素 (Cytokinins)、脫落酸(Abscisic acids) 和乙烯(Ethylene) 五類,已發(fā)表的文獻(xiàn)主要是考察其中某些酸 性[11]或者堿性[12]的植物激素,缺乏全面性,本研究考察的 4 種植物激素 IAA, ZT, ABA 和 GA3,分別屬 于生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉素。 本方法有利于全面考察農(nóng)作物中植物激素含量。
 

　　2 實(shí)驗(yàn)部分 2. 1 儀器與試劑 雙三元液相色譜系統(tǒng) ( 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司),配備 SRD3600 六通道真空脫氣機(jī), DGP3600 RS 雙梯度快速分析型色譜泵(兩個(gè)*一致,同時(shí)又相互獨(dú)立的三元泵,通過(guò) Chromeleon 軟 件一體化控制),WPS3000TSL 自動(dòng)進(jìn)樣器,TCC鄄3000 柱溫箱(配有兩個(gè)六通閥),Chromeleon 6. 8 變色龍 色譜管理軟件。 質(zhì)譜系統(tǒng):TSQ Vantage 三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng),配有 Xcalibur 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)賽默飛 世爾科技有限公司),離子源:HESI。 赤霉素(GA3)、吲哚乙酸( IAA)、玉米素( ZT) 和脫落酸(ABA) 標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó) Sigma鄄aldrich 有限公 司); 乙腈、甲醇 (Optima 級(jí),美國(guó) Fisher 公司),去離子水(18. 2 M贅 cm,Thermo 純水機(jī)制備)。 植株樣 品采自于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)作物實(shí)驗(yàn)基地(黑龍江省大慶市林甸縣),檢測(cè)樣品采用液氮冷凍后,用 超低溫冰箱保存。 2. 2 樣品處理 大豆檢測(cè)樣品(葉片、莢皮、籽粒)冷凍貯存于-80 益冰箱中。 取 1 g 樣品,于液氮中研磨成粉末,轉(zhuǎn) 入 6 mL 預(yù) 冷 的 80% 甲 醇 ( 含 1 mmol / L BHT ), 于 4 益 下 避 光 浸 提 12 h, 于 4 益 下, 以 4000 r/ min 離心 15 min, 分離上清液,沉淀物中加 2 mL 預(yù)冷的 80% 甲醇,再于 4 益下浸提 2 h,離心,合 并上清液,定容至 10 mL,用去離子水 1頤 1 稀釋,過(guò) 0. 22 滋m 濾膜后,待測(cè)。 2. 3 在線固相萃取和色譜分離條件 SPE Column:Thermo Hypersep Retain AX 柱(20 mm伊3. 0 mm, 3 滋m), 左泵(Online SPE Pump),流 動(dòng)相:甲醇(A)鄄水(B)。 分析柱:Thermo Acclaim PA2 色譜柱(150 mm伊2. 1 mm, 3 滋m),右泵 (Analyti鄄 cal Pump),流動(dòng)相:甲醇(A)鄄0. 1% FA(B);柱溫:35 益 ,進(jìn)樣量:10 滋L,六通閥切換程序及梯度淋洗條 件見(jiàn)表 1,Online SPE 流路見(jiàn)圖 1。
 

　　Auto tune 模式: 將 1 mg / L 標(biāo)準(zhǔn)液通過(guò)蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)樣。 由 TSQ Tune 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化軟件自動(dòng)獲得 的子離子碰撞能量及透鏡電壓等,相應(yīng)離子對(duì)與文獻(xiàn)[11,12]相同,如圖 2 所示。 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM):針對(duì)二級(jí)質(zhì)譜或多級(jí)質(zhì)譜的某兩級(jí)之間,即母離子選一個(gè)離子,碰撞后,從 形成的子離子中也只選一個(gè)離子。 因?yàn)閮纱味贾贿x單離子,所以噪音和干擾被排除得更多,靈敏度和信 噪比會(huì)更高,尤其對(duì)于復(fù)雜的、基質(zhì)背景高的樣品(見(jiàn)圖)。 質(zhì)譜條件:吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)采用正離子掃描方式、赤霉素(GA3 )和脫落酸(ABA)采用 負(fù)離子掃描方式,同時(shí)正負(fù)切換。 霧化溫度:350 益 ,鞘氣 30 arb,輔助氣:10 arb,Collision Gas Pressure:1. 5 mTorr,離子傳輸管溫度 270 益 ,質(zhì)譜掃描參數(shù): 掃描方式: SRM, 掃描循環(huán)時(shí)間: 0. 8 s, 分辨率: Q1, Q3 分辨率均設(shè)置為 0. 4 FWHM。 具體的加熱電噴霧電離(HESI) 模式掃描條件件見(jiàn)表 2。
 

　　3 結(jié)果與討論 3. 1 SPE 柱的選擇 SPE 的分離保留機(jī)理有反相、正相、離子交換、體積排阻、免疫親和等,GA3 、ABA、IAA 的 pKa分別為 第 12 期 賈鵬禹等: 在線固相萃取鄄高效液相色譜鄄串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)大豆不同部位的 4 種植物激素 1745 4. 2,4. 5,4. 7,為酸性化合物; ZT 的 pKa = 11. 4,為堿性化合物。 現(xiàn)有的 SPE 方法多數(shù)只同時(shí)分析酸 性[11]或者堿性的植物激素[12] ,這樣只能得到片面的結(jié)果。 或者采用兩次不同的 SPE (MAX、MCX)方 式分別純化酸性或堿性植物激素,后合并凈化后的樣品[13] ,其涉及的前處理過(guò)程十分復(fù)雜,影響重現(xiàn) 性等。 本方法對(duì) SPE 柱類型、上樣流速、pH 值、有機(jī)試劑等影響在線分析的主要因素進(jìn)行了分析。 選擇 TurboFlow MCX,TurboFlow MAX,AG19,Retain CX,Retain AX 進(jìn)行比較。 其中,TurboFlow 系列 柱需要運(yùn)用體積排阻、離子交換、反相保留的機(jī)理,上樣速度一般要求 2 mL / min,以形成渦流,但在對(duì) 4 種植物激素的保留過(guò)程中, 始終無(wú)法同時(shí)保留,尤其是 GA3 在 TurboFlow 柱上始終在死時(shí)間直接被洗 脫下來(lái)。 AG19 是一種運(yùn)用在離子色譜上的陰離子交換保護(hù)柱,對(duì)酸性化合物有較好的保留性能,但對(duì) 上樣溶劑的 pH 值有一定的要求,只能用中性流動(dòng)相上樣,否則難以保留,這就與 MCX 的上樣條件相沖 突。 考慮到通過(guò)在 Retain AX 是一種高純度,高滲透的苯乙烯二乙烯基聚合物,通過(guò)鍵合季氨基增加對(duì) 酸性化合物(GA3 , ABA, IAA)的保留,同時(shí)具有一定的反相保留性能,可保留堿性化合物 ZT。 流動(dòng)相的選擇對(duì)在線固相萃取具有顯著影響,甲醇、乙腈是反相色譜中常用的有機(jī)試劑,本方法選 擇流動(dòng)相主要是考慮其對(duì)分析物的保留與基質(zhì)的分離和在質(zhì)譜中離子響應(yīng)的高低。 在選定 Retain AX 柱作為 SPE 柱后,當(dāng)用乙腈作為流動(dòng)相時(shí),堿性的 ZT 在 Retain AX 柱上的保留性能明顯下降,在死時(shí)間 直接被洗脫下來(lái),無(wú)法與基質(zhì)分離;但選擇甲醇作為上樣流動(dòng)相時(shí),這種情況就可以避免,推斷 ZT 在 Retain AX 上的保留主要是依靠反相色譜原理,與其在反相色譜中的保留性能有明顯的相關(guān)性。 本方法 同時(shí)采集正負(fù)離子信號(hào),不宜添加過(guò)多的酸堿離子添加劑。 在相同條件下,采用甲醇作為分析流動(dòng)相 時(shí),植物激素的響應(yīng)值明顯優(yōu)于乙腈。 綜合以上因素,本方法選擇甲醇鄄水作為分析流動(dòng)相。
 

　　4 結(jié) 論 本實(shí)驗(yàn)建立了雙三元液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 測(cè)定大豆不同部位的內(nèi)源激素在線固相萃取 液質(zhì)聯(lián)用分析方法。 在滿足常規(guī)分析的同時(shí), 針對(duì)本實(shí)驗(yàn)中遇到的基質(zhì)干擾大、樣品前處理 復(fù)雜、重現(xiàn)性差、目標(biāo)分析物含量低等問(wèn)題 通過(guò) Online SPE 技術(shù)在線除雜富集解決,有較多成熟的應(yīng)用[15,16] 。 通過(guò)與已發(fā)表的關(guān)于植物激素研究的文獻(xiàn)比較[11,12] ,本方法的檢測(cè)限有明顯優(yōu)勢(shì),通過(guò)選擇合適 的 SPE 柱,保證不同性質(zhì)的植物激素可以同時(shí)保留,與基質(zhì)分離,一次進(jìn)樣同時(shí)檢測(cè)酸堿性植物激素, 第 12 期 賈鵬禹等: 在線固相萃取鄄高效液相色譜鄄串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)大豆不同部位的 4 種植物激素 1747 檢測(cè)結(jié)果更加全面,提高了檢測(cè)效率。 文獻(xiàn)[17]采用 HPLC 方法分析大豆中的植物激素, GA3 檢出限 為 0. 5 滋g / g,樣品未檢出,ABA 含量明顯高于其它成分。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[17]相符。 本方法樣品前 處理簡(jiǎn)單方便,靈敏度高,固相萃取在線分析技術(shù)是一種高通量,快速的植物內(nèi)源激素檢測(cè)技術(shù),檢出限 *能滿足農(nóng)業(yè)科學(xué)研究需要。 被測(cè)組分提取、濃縮、分離的在線進(jìn)行,不僅省時(shí)而且改善了檢出限;而 且具有抗化學(xué)干擾、可靠性好的優(yōu)點(diǎn),特別適用于復(fù)雜基質(zhì)中低含量組分的檢出。 本方法將有望廣泛地 應(yīng)用于農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域生理生化指標(biāo)中被測(cè)物的高靈敏度、高準(zhǔn)確度檢測(cè)。