FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)
FKM（Fluorescence Kinetic Microscope）多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)是目前功能強(qiáng)大全面的植物顯微熒光研究儀器，是基于FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的顯微成像定制系統(tǒng)。它由包含可擴(kuò)展部件的增強(qiáng)顯微鏡、高分辨率CCD相機(jī)、激發(fā)光源組、光譜儀、控溫模塊以及相應(yīng)的控制單元和的工作站與分析軟件組成。它不僅可以進(jìn)行微藻、單個(gè)細(xì)胞、單個(gè)葉綠體乃至基粒-基質(zhì)類囊體片段進(jìn)行Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等各種葉綠素?zé)晒饧癕CF多光譜熒光（multicolor fluorescence）成像分析；還能通過激發(fā)光源組進(jìn)行進(jìn)行任意熒光激發(fā)和熒光釋放波段的測量，從而進(jìn)行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白、熒光染料以及藻青蛋白、藻紅蛋白、藻膽素等藻類*熒光色素的成像分析；更可以利用光譜儀對各種熒光進(jìn)行光譜分析，區(qū)分各發(fā)色團(tuán)（例如PSI和PSII及各種捕光色素復(fù)合體等）并進(jìn)行深入分析。
FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統(tǒng)使熒光成像技術(shù)真正成為光合作用機(jī)理研究的探針，使科研工作者在藻類和高等植物細(xì)胞與亞細(xì)胞層次深入理解光合作用過程及該過程中發(fā)生的各種變化，為直接研究葉綠體中光合系統(tǒng)的工作機(jī)理提供了有力的工具。FKM作為藻類/植物表型和基因型顯微研究的雙重利器，得到了學(xué)界的廣泛認(rèn)可并取得了大量的科研成果。
功能特點(diǎn)
?內(nèi)置現(xiàn)今葉綠素?zé)晒庋芯康娜砍绦?，如Fv/Fm、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等，可獲得70余項(xiàng)參數(shù)。
?配備10倍、20倍、40倍、63倍和100倍生物熒光物鏡，可以清晰觀測到葉綠體及其發(fā)出的熒光。
?激發(fā)光源組中包括紅外光、紅光、藍(lán)光、綠光、白光、紫外光和遠(yuǎn)紅光等，通過紅藍(lán)綠三色光還可以調(diào)出可見光譜中的任何一種色光，能夠研究植物/藻類中任何一種色素分子或發(fā)色團(tuán)。
?可進(jìn)行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白、熒光染料的成像分析
?高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖。
?控溫系統(tǒng)可以保證實(shí)驗(yàn)樣品在同等溫度條件下進(jìn)行測量，提高實(shí)驗(yàn)精度，也可以進(jìn)行高溫/低溫脅迫研究。
應(yīng)用領(lǐng)域
? 微藻、大型藻類/高等植物的單個(gè)細(xì)胞、單個(gè)葉綠體、基粒-基質(zhì)類囊體片段等的顯微結(jié)構(gòu)植物光合生理研究
? 藻類/植物逆境研究
? 生物和非生物脅迫的研究
? 藻類/植物抗脅迫能力及易感性研究
? 突變體篩選及光合機(jī)理研究
? 藻類長勢與產(chǎn)量評估
? 藻類*色素與光合作用關(guān)系
? 藻類/植物——微生物交互作用研究
? 藻類/植物——原生動(dòng)物交互作用研究
? 基因工程與分子生物學(xué)研究
測量樣品
? 植物活體切片
? 植物表皮
? 植物細(xì)胞
? 綠藻、藍(lán)藻等各種單細(xì)胞和多細(xì)胞微藻
? 葉綠體提取液
? 類囊體提取液
? 含有葉綠體的原生動(dòng)物
工作原理
FKM分析過程中，通過連接在顯微鏡上的激發(fā)光源組和內(nèi)置在6位濾波輪中的一系列濾波器、分光鏡激發(fā)植物樣品中各種發(fā)色團(tuán)的動(dòng)態(tài)熒光。樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)顯微鏡放大后進(jìn)行熒光光譜分析和熒光動(dòng)力學(xué)成像分析。SM 9000光譜儀通過光纖與顯微鏡連接，以進(jìn)行激發(fā)熒光光譜分析。安裝在顯微鏡頂部的高分辨率CCD相機(jī)則用于熒光動(dòng)力學(xué)成像分析。全部工作過程通過工作站和控制單元按照預(yù)先設(shè)定好的程序自動(dòng)進(jìn)行。測量過程中，可通過溫控模塊調(diào)控藻類、植物細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)樣品的溫度。蠕動(dòng)泵可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)藻類的連續(xù)測量。
儀器組成
1. 增強(qiáng)顯微鏡
2. 高分辨率CCD相機(jī)
3. 激發(fā)光源組
4. SM 9000光譜儀
5. 主控制單元
6. 工作站及軟件
7. 控溫模塊的控制單元
8. 6位濾波輪
技術(shù)參數(shù)
? 測量參數(shù)
? Fo, Fo’, Fs, Fm, Fm’, Fp, FtDn, FtLn, Fv, Fv'/ Fm', Fv/ Fm ,Fv',Ft,ΦPSII, NPQ_Dn, NPQ_Ln, Qp_Dn, Qp_Ln, qN, qP，QY, QY_Ln, Rfd, ETR等50多個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)，每個(gè)參數(shù)均可顯示2維熒光彩色圖像
? OJIP快速熒光曲線：測定分析OJIP曲線與二十幾項(xiàng)相關(guān)參數(shù)包括：Fo、Fj、Fi、P或Fm、Vj、Vi、Mo、Area 、Fix Area、Sm 、Ss 、N（QA還原周轉(zhuǎn)數(shù)量）、Phi???_Po 、Psi_o 、Phi_Eo、Phi_Do、Phi_pav、ABS/RC（單位反應(yīng)中心的吸收光量子通量）、TRo/RC（單位反應(yīng)中心初始捕獲光量子通量）、ETo/RC（單位反應(yīng)中心初始電子傳遞光量子通量）、DIo/RC（單位反應(yīng)中心能量散失）、ABS/CS（單位樣品截面的吸收光量子通量）、TRo/CSo、RC/CSx（反應(yīng)中心密度）、PIABS（基于吸收光量子通量的“性能”指數(shù)或稱生存指數(shù)）、PIcs（基于截面的“性能”指數(shù)或稱生存指數(shù)）等（選配）
? GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白和熒光染料的成像分析（選配）
? QA再氧化動(dòng)力學(xué)曲線（選配）
? Spectrum熒光光譜圖（選配）
?具備完備的自動(dòng)測量程序（protocol），可自由對自動(dòng)測量程序進(jìn)行編輯
? Fv/Fm：測量參數(shù)包括Fo，F(xiàn)m，F(xiàn)v，QY等
? Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)：Fo，F(xiàn)p，F(xiàn)v，F(xiàn)t_Lss，QY，Rfd等熒光參數(shù)
? 熒光淬滅分析：Fo，F(xiàn)m，F(xiàn)p，F(xiàn)s，F(xiàn)v，QY，ΦII，NPQ，Qp，Rfd，qL等50多個(gè)參數(shù)，2套制式程序
? 光響應(yīng)曲線LC：Fo，F(xiàn)m，QY，QY_Ln，ETR等熒光參數(shù)
? Dyes & FPs穩(wěn)態(tài)熒光成像測量
? OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)分析：Mo（OJIP曲線初始斜率）、OJIP固定面積、Sm（對關(guān)閉所有光反應(yīng)中心所需能量的量度）、QY、PI等26個(gè)參數(shù)（選配）
? QA再氧化動(dòng)力學(xué)（選配）
? Spectrum熒光光譜分析（選配）
?熒光激發(fā)光源：紅外光、紅光、橙光、藍(lán)光、綠光、白光、紫外光等可選，根據(jù)客戶要求定制光源組
?透射光源（選配）：白光、遠(yuǎn)紅光
? 高分辨率TOMI-2 CCD傳感器：
? 逐行掃描CCD
? 圖像分辨率：1360×1024像素
? 時(shí)間分辨率：在圖像分辨率下可達(dá)每秒20幀
? A/D 轉(zhuǎn)換分辨率：16位（65536灰度色階）
? 像元尺寸：6.45µm×6.45µm
? 運(yùn)行模式：1）動(dòng)態(tài)視頻模式，用于葉綠素?zé)晒鈪?shù)測量；2）快照模式，用于GFP等熒光蛋白和熒光染料測量
? 通訊模式：千兆以太網(wǎng)
?顯微鏡：Axio Imager M2，可選配Axio Scope A1簡潔版或Axio Imager Z2高級(jí)版
? 物鏡轉(zhuǎn)盤：研究級(jí)7孔自動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)盤
? 透射光快門
?聚光器 Achr Apl 0.9 H
? 6位反光鏡轉(zhuǎn)盤
? 雙目鏡筒(100:0/30:70/0:100)
? 機(jī)械載物臺(tái)：75×50mm，硬膜陽極氧化表面
? 樣品架：76×26mm
?物鏡：10倍、20倍、40倍、63倍和100倍生物熒光物鏡（可選）
?6位濾波輪：葉綠素?zé)晒?、GFP/SYTOX、DAPI/CTC等
?SM9000光譜儀
? 入射狹縫：70µm×1400µm
? 光柵：平場型校正
? 光譜范圍：200-980nm
? 波長精確度：<0.5nm
? 再現(xiàn)性：<0.1nm
? 溫度漂移：<0.01nm/K
?溫度調(diào)控模塊：溫度調(diào)節(jié)范圍 5℃-70℃，精確度0.1℃
?蠕動(dòng)泵（選配）：流速10-5600µl/min，用于藻類連續(xù)培養(yǎng)測量
?FluorCam葉綠素?zé)晒獬上穹治鲕浖δ埽壕週ive（實(shí)況測試）、Protocols（實(shí)驗(yàn)程序選擇定制）、Pre–processing（成像預(yù)處理）、Result（成像分析結(jié)果）等功能菜單
?客戶定制實(shí)驗(yàn)程序協(xié)議（protocols）：可設(shè)定時(shí)間（如測量光持續(xù)時(shí)間、光化學(xué)光持續(xù)時(shí)間、測量時(shí)間等）、光強(qiáng)（如不同光質(zhì)光化學(xué)光強(qiáng)度、飽和光閃強(qiáng)度、調(diào)制測量光等），具備實(shí)驗(yàn)程序語言和腳本，用戶也可利用Protocol菜單中的向?qū)С绦蚰０孀杂蓜?chuàng)建新的實(shí)驗(yàn)程序
?自動(dòng)測量分析功能：可設(shè)置一個(gè)實(shí)驗(yàn)程序（Protocol）自動(dòng)無人值守循環(huán)成像測量，重復(fù)次數(shù)及間隔時(shí)間客戶自定義，成像測量數(shù)據(jù)自動(dòng)按時(shí)間日期存入計(jì)算機(jī)（帶時(shí)間戳）
?快照（snapshot）模式：通過快照成像模式，可以自由調(diào)節(jié)光強(qiáng)、快門時(shí)間及靈敏度得到清晰突出的植物樣本穩(wěn)態(tài)熒光和瞬時(shí)熒光圖片
?成像預(yù)處理：程序軟件可自動(dòng)識(shí)別多個(gè)植物樣品或多個(gè)區(qū)域，也可手動(dòng)選擇區(qū)域（Region of interest，ROI）。手動(dòng)選區(qū)的形狀可以是方形、圓形、任意多邊形或扇形。軟件可自動(dòng)測量分析每個(gè)樣品和選定區(qū)域的熒光動(dòng)力學(xué)曲線及相應(yīng)參數(shù)，樣品或區(qū)域數(shù)量不受限制（>1000）
?數(shù)據(jù)分析模式：具備“信號(hào)計(jì)算再平均”模式（算數(shù)平均值）和“信號(hào)平均再計(jì)算”模式，在高信噪比的情況下選用“信號(hào)計(jì)算再平均”模式，在低信噪比的情況下選擇“信號(hào)平均再計(jì)算”模式以過濾掉噪音帶來的誤差
?輸出結(jié)果：高時(shí)間解析度熒光動(dòng)態(tài)圖、熒光動(dòng)態(tài)變化視頻、熒光參數(shù)Excel文件、直方圖、不同參數(shù)成像圖、不同ROI的熒光參數(shù)列表等
葉綠素?zé)晒馀c光譜分析結(jié)果
典型應(yīng)用：
產(chǎn)地：捷克
參考文獻(xiàn)：
1.Küpper H, et al. 2019. Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kinetics by Direct Fast Imaging. Plant Physiology 179: 369-381
2.Konert G, et al. 2019. Protein arrangement factor: a new photosynthetic parameter characterizing the organization of thylakoid membrane proteins. Physiologia Plantarum 166: 264-277.
3.Exposito-Rodriguez M, et al. 2017. Photosynthesis-dependent H2O2 transfer from chloroplasts to nuclei provides a high-light signalling mechanism. Nature Communications, 8: 49
4.Higo S, et al. 2017. Application of a pulse-amplitude-modulation (PAM) fluorometer reveals its usefulness and robustness in the prediction of Karenia mikimotoi blooms: A case study in Sasebo Bay, Nagasaki, Japan. Harmful Algae, 61:63-70
5.Jacobs M, et al. 2016. Photonic multilayer structure of Begonia chloroplasts enhances photosynthetic efficiency. Nature Plants, doi:10.1038/nplants.2016.162
6.Andresen E, et al. 2016. Cadmium toxicity investigated at the physiological and biophysical levels under environmentally relevant conditions using the aquatic model plant Ceratophyllum demersum. New Phytol., 210(4):1244-1258
7.Thomas G, et al. 2016. Deficiency and toxicity of nanomolar copper in low irradiance—A physiological and metalloproteomic study in the aquatic plant Ceratophyllum demersum. Aquatic Toxicology, 177:226-236
8.Fujise L, et al. 2014. Moderate Thermal Stress Causes Active and Immediate Expulsion of Photosynthetically Damaged Zooxanthellae (Symbiodinium) from Corals. PLOS ONE, DOI:10.1371/journal.pone.0114321
9.Gorecka M, et al. 2014. Abscisic acid signalling determines susceptibility of bundle sheath cells to photoinhibition in high light-exposed Arabidopsis leaves. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 369(1640), DOI: 10.1098/rstb.2013.0234
10.Mishra S, et al. 2014. A different sequence of events than previously reported leads to arsenic-induced damage in Ceratophyllum demersum L. Metallomics, 6: 444-454
11.Ferimazova N, et al. 2013. Regulation of photosynthesis during heterocyst differentiation in Anabaena sp. strain PCC 7120 investigated in vivo at single-cell level by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy. Photosynthesis Research, 116(1): 79-91
12.Andresen E, et al. 2013. Effects of Cd & Ni toxicity to Ceratophyllum demersum under environmentally relevant conditions in soft & hard water including a German lake. Aquatic Toxicology. 142–143, 15: 387–402
