熒光原位雜交 (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) 是指利用熒光染料標(biāo)記的，已知序列的單鏈核酸作為探針，通過堿基互補(bǔ)配對原則，與待檢樣品中核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，然后通過觀察熒光信號，從而對樣品中待檢核酸進(jìn)行定性，定量及定位分析。FISH 具有快速，信號強(qiáng)，特異性高以及可以多重染色等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，基因組結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域。
影響 FISH 結(jié)果的因素有很多，包括樣品準(zhǔn)備和處理，顯微鏡，光源，熒光探針以及濾光片。FISH 通?；跓晒怙@微鏡來觀測信號，所用濾光片包括激發(fā)片，二向色鏡和發(fā)射片三種。其工作原理如下圖所示：
激發(fā)片: 選擇透過光源的某部分波段的光，用來激發(fā)熒光探針；
二向色鏡: 反射光源的光至樣品，透過產(chǎn)生的熒光并反射激發(fā)光的散射光；
發(fā)射片: 選擇透過熒光的某部分波段的光至檢 測器或人眼，并*阻擋掉激發(fā)光的雜散光。
在 FISH 實(shí)驗(yàn)中，濾光片帶寬的大小會對 FISH 圖像的對比度產(chǎn)生重要的影響。增加帶寬會提高激發(fā)和接收效率，使接收的信號增強(qiáng)。但實(shí)際接收的信號中同時包含了探針的熒光信號和樣品的背底噪音，帶寬的增加會同時增加這兩者的強(qiáng)度。帶寬減小，雖然可以降低背底噪音的強(qiáng)度，但熒光信號也會隨之減弱 。所以對于對比度要求很高的 FISH 實(shí)驗(yàn)，針對于每種具體的染料，都會存在一個*的帶寬，使 FISH 圖像能夠達(dá)到*的對比度。Chroma的FISH 濾光片的帶寬都是根據(jù)常用的 FISH 染料做過優(yōu)化，可以為用戶的 FISH 實(shí)驗(yàn)提供*的對比度的圖像。
FISH 實(shí)驗(yàn)中的噪音主要來自三個方面：
(1) 細(xì)胞或組織的自發(fā)熒光;
(2) 試劑的自發(fā)熒光;
(3) 熒光探針的非特異性結(jié)合;
Chroma FISH 濾光片組具有以下特點(diǎn):
·保證足夠亮度的同時，提供*的對比度；
·消除串色的影響；
a. 消除 Gold 和 Aqua 串色到 Green 通道；
b. 消除 Gold 和 Orange 串色到 Red 通道；
·對多波段濾光片組中的 DAPI 通道進(jìn)行特殊處理，避免 DAPI 信號過強(qiáng)而將其他信號掩蓋；
·多色圖像疊加零漂移；
·磁控濺射鍍膜，終身質(zhì)保。
FISH 單波段帶通濾光片組：
濾光片組 | 激發(fā)片 CWL/FWHM | 發(fā)射片 CWL/FWHM | 二向色鏡 50% cut-on | FISH 探針 |
49000 | 350/50 | 460/50 | 400 | DAPI |
49028 | 395/25 | 460/50 | 425 | DAPI **用于395nm 光源 |
49301 | 405/10 | 460/36 | 425 | Spectrum Blue/ZyBlue |
49302 | 436/20 | 480/30 | 455 | Spectrum Aqua |
49303 | 495/25 | 537/29 | 515 | Spectrum Green/ZyGreen **用于有Aqua，無 Gold 時 |
49308 | 485/25 | 525/30 | 505 | Spectrum Green/ZyGreen **用于無 Aqua，有 Gold 時 |
49312 | 490/20 | 525/20 | 505 | Spectrum Green/ZyGreen **用于有 Aqua，有 Gold 時 |
49304 | 546/10 | 572/23 | 556 | SpectrumGold/ZyGold |
49305 | 546/22 | 590/33 | 565 | Spectrum Orange/ZyOange **用于無 Red 時 |
49309 | 539/21 | 576/31 | 556 | Spectrum Orange/ZyOange **用于有 Red 時 |
49306 | 580/25 | 625/30 | 600 | Spectrum Red/ZyRed **用于無 Gold，無 Orange 時 |
49310 | 592/21 | 630/30 | 610 | Spectrum Red/ZyRed **用于有 Gold，無 Orange 時 |
49311 | 599/13 | 632/28 | 612 | Spectrum Red/ZyRed **用于有 Orange 時 |
49307 | 630/20 | 667/30 | 647 | Spectrum Far Red |
49009 | 640/30 | 690/50 | 660 | Spectrum Far Red |
FISH 雙波段帶通濾光片組：
濾光片組 | 激發(fā)片 CWL/FWHM | 發(fā)射片 CWL/FWHM | 二向色鏡 50% cut-on | FISH 探針 |
探針1 | 探針2 |
59001v2 | Multi Bａnd 394/30 483/26 | Multi Bａnd 443/36 527/40 | Multi Bａnd 420 502 | DAPI | Green |
59002v2 | Multi Bａnd 394/30 544/30 | Multi Bａnd 462/35 590/41 | Multi Bａnd 430 566 | DAPI | Orange |
59003v2 | Multi Bａnd 394/30 576/30 | Multi Bａnd 462/35 627/50 | Multi Bａnd 442 600 | DAPI | Red |
59010 | Multi Bａnd 490/20 585/22 | Multi Bａnd 526/25 628/34 | Multi Bａnd 508 605 | Green | Red |
59011 | Multi Bａnd 480/30 560/25 | Multi Bａnd 521/34 606/40 | Multi Bａnd 503 585 | Green | Orange |
59012 | Multi Bａnd 475/60 552/24 | Multi Bａnd 515/30 597/46 | Multi Bａnd 495 570 | Green | Orange |
59033 | Multi Bａnd 436/20 535/25 | Multi Bａnd 480/23 580/30 | Multi Bａnd 462 558 | Aqua | Gold |
FISH 三波段帶通濾光片組：
濾光片組 | 激發(fā)片 CWL/FWHM | 發(fā)射片 CWL/FWHM | 二向色鏡 50%cut-on | FISH 探針 |
探針1 | 探針2 | 探針3 |
69008 | Multi Bａnd 435/22 501/20 575/24 | Multi Bａnd 469/25 536/29 635/69 | Multi Bａnd 453 517 595 | Aqua | Green | Red |
69011 | Multi Bａnd 434/21 498/20 566/28 | Multi Bａnd 468/22 530/25 610/40 | Multi Bａnd 453 514 588 | Aqua | Green | Orange |
69013v2 | Multi Bａnd 395/25 480/30 560/25 | Multi Bａnd 440/31 520/35 605/41 | Multi Bａnd 420 504 585 | DAPI | Green | Orange |
89084v2 | Multi Bａnd Ex1 480/30 560/25 | Multi Band 440/31 520/35 605/41 | Multi Band 420 504 585 |
| Green | Orange |
Multi Bａnd Ex2 395/25 480/30 560/25 | DAPI | Green | Orange |
Singe Band 395/25 480/30 560/25 | DAPI | Green | Orange |
69015 | Multi Band 395/25 490/20 585/22 | Multi Band 450/30 525/25 627/34 | Multi Band 419 508 605 | DAPI | Green | Red |
89085 | Multi Bａnd Ex1 490/20 585/22 | Multi Band 450/30 525/25 627/34 | Multi Band 419 508 605 |
| Green | Red |
Multi Bａnd Ex2 395/25 490/20 585/22 |
| Green | Red |
Single Band 395/25 490/20 585/22 | DAPI |
| Red |
FISH 三波段帶通濾光片組：
濾光片組 | 激發(fā)片 CWL/FWHM | 發(fā)射片 CWL/FWHM | 二向色鏡 50% cut-on | FISH 探針 |
探針1 | 探針2 | 探針3 | 探針4 |
69014 | Multi Bａnd 387/10 432/25 498/20 566/28 | Multi Bａnd 468/22 530/25 610/40 | Multi Bａnd 453 514 588 | DAPI | Aqua | Green | Orange |
