引物設(shè)計(jì)與合成實(shí)驗(yàn)外包.
一、 引物設(shè)計(jì)與合成實(shí)驗(yàn)外包.原則
聚合梅鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA 序列的方法，故又稱基因的體外擴(kuò)增法。PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用zui多，zui廣泛的手段之一，而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行，可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。引物設(shè)計(jì)原則如下：
1、引物應(yīng)在序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)并具有特異性。引物序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性；
2、引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp。常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)；
3、引物不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高(超過(guò)4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行；
4、引物序列的GC含量一般為40-60%。過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大；
5、引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件*。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；
6、引物5'端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物?？筛鶕?jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。
7、引物3'端不可修飾。引物3'端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3'端使用堿基A。
8、引物序列自身或者引物之間不能在出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加；
9、G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3'端 G值較低（值不超過(guò)9），而5'端和中間 G值相對(duì)較高的引物。引物的3'端的 G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)；
值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低，在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
引物設(shè)計(jì)與合成實(shí)驗(yàn)外包.服務(wù)特點(diǎn)：
1. 提供引物設(shè)計(jì)的參考序列，設(shè)計(jì)原理和分析報(bào)告，讓您對(duì)您的引物或探針的性能和特點(diǎn)有一個(gè)全面的了解，便于您對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的認(rèn)識(shí)和分析。
2. 可提供擴(kuò)增前的與處理及擴(kuò)增后服務(wù)：包括，核酸提取，pcr，核酸純化，序列分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)等服務(wù)。
3. 一次的服務(wù)，全程的保障。
