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免疫熒光實(shí)驗(yàn)外包1.材料準(zhǔn)備
1)蓋玻片.載玻片
蓋玻片 水洗 浸泡于75%的乙醇溶液
超聲波 泡酸
載玻片 水洗 無水乙醇浸泡 烘干
2)試劑
a.固定液: 4%甲醛, 4%多聚甲醛(PBS,72度溶解)
b.透膜液:0.2%或0.3%triton X-100, 甲醇+丙酮(V:V=1:1)
c.封閉液:5%BSA
以上試劑除甲醇+丙酮外均用PBS配制
d.一抗:Rabit-anti-HA(1:500) ,Mouse-anti-myc( 1:500),
Mouse-anti-flag(1:1500),
e.二抗:
Goat-anti-Rabbit FITC(1:500) , Goat-anti-Rabbit-Mouse Texas(1:500)
一抗二抗 均用封閉液稀釋
f. Hoechst 5ug/ml PBS稀釋
g. 90%甘油溶于PBS
h . 指甲油
2. 蓋玻片處理
在細(xì)胞培養(yǎng)之前為了讓某些細(xì)胞(例如293,293T)的貼壁性能提高需對蓋玻片進(jìn)行處理,常用的處理方法有:
A:凝膠(gelatin)處理:
1.配制2%的凝膠水溶液,高壓滅菌(同時也有助于凝膠的溶解)
2.將適量蓋玻片(一般不超過40片)放入10cm的細(xì)胞培養(yǎng)盤
3.加入10ml 2%的凝膠溶液放在脫色搖床上,在室溫下shake1小時。
4.將200ul的25%的異戊二醛加到10ml的新配制的1xPBS
5.吸去凝膠溶液,加入新配制的異戊二醛溶液,室溫下?lián)u15分鐘。
6.用PBS洗5次,每次5分鐘。
7.將蓋玻片放在30mm盤或者是六空板,UV照射1小時,備用。
B:多聚賴氨酸處理
1.將洗干靜的蓋玻片放在40 μg/ml多聚賴氨酸處理溶液中,室溫下浸泡大約1小時
2.自來水沖洗1小時,然后用蒸餾水浸泡3次,每次5分鐘。
3 UV照射3小時,備用。
3.細(xì)胞培養(yǎng)
根據(jù)細(xì)胞的不同生長速度而調(diào)節(jié)分細(xì)胞時的密度,一般說來,在細(xì)胞固定前其密度達(dá)到1X106
為宜1X106
4.轉(zhuǎn)染
為了檢測某種蛋白分子的細(xì)胞內(nèi)定位或者觀察兩種蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)的共定位,常常將某基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),常用的有PEI,磷酸鈣轉(zhuǎn)染法等。
5.染色
1).轉(zhuǎn)染24hr后,吸去培養(yǎng)液,PBS洗一次
2).固定: 4%甲醛或 4%多聚甲醛, 20min, PBS洗二次
3).透膜:a. 0.2%或0.3%triton X-100, RT,10min ,PBS洗二次
b.甲醇+丙酮(V:V=1:1), -20 °, 20min, PBS洗三次
4).封閉:封閉液800ul, RT,60min (時間可以長些,4° )
5).一抗:100ul ,RT ,1hr 或者37 °,45min,PBS洗5次,5min/time
6).二抗:100ul ,RT ,1hr 或者37 °,45min,PBS洗2次,5min/time
7).染核:Hoechst,200ul,10min, PBS洗4次,5min/time
8).封片:9ul 90%甘油. 不要留有氣泡。
6. 熒光顯微鏡觀察


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