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北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院席鵬團隊開發(fā)保真優(yōu)先的熒光顯微鏡反卷積方法

2024-09-06 08:46:25來源：北京大學(xué)關(guān)鍵詞：熒光顯微鏡閱讀量：11668

　　【儀器網(wǎng) 科技成果】熒光顯微鏡是活細胞成像中的重要工具。超分辨率顯微鏡的提出進一步打破了熒光顯微鏡的衍射極限，使得觀察更為精細的細胞結(jié)構(gòu)成為可能。然而，成像過程中的隨機噪聲以及光學(xué)模糊影響了熒光成像質(zhì)量。在活細胞成像中，高光子劑量對細胞狀態(tài)造成影響，并且會導(dǎo)致光漂白，增加了獲得高信噪比圖像的難度。在超快成像中，曝光時間不足也制約著高信噪比圖像的獲得。綜合而言，熒光成像中的成像速度、持續(xù)時間和分辨率等關(guān)鍵參數(shù)受到了極大限制。

　　反卷積算法(deconvolution)在熒光成像領(lǐng)域得到了很大應(yīng)用，因為它們具有通過以低光子預(yù)算從豐富的噪聲中恢復(fù)熒光信號來提高成像持續(xù)時間和時空分辨率的潛力。盡管算法補償在增強這些熒光成像的關(guān)鍵方面顯示出了巨大的潛力，但其保真度，尤其是在分辨率提升方面仍然受到質(zhì)疑。此外開發(fā)能夠工作在更低信噪比的反卷積算法，可以進一步地提高成像時程以及速度，為發(fā)現(xiàn)新生物現(xiàn)象提供更多可能。

　　為了解決上述問題，北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院席鵬教授團隊重塑了熒光成像反卷積算法的噪聲控制模型以及分辨率提升機制，提出了多分辨率(Multi-resolution analysis, MRA)反卷積算法。該方法有效提高了反卷積算法可以恢復(fù)的最低信噪比極限，并解決了傳統(tǒng)反卷積算法在分辨率提高時容易產(chǎn)生偽影的缺陷。該文章以“Multi-resolution analysis enables fidelity-ensured deconvolution for fluorescence microscopy”為題發(fā)表在eLight。

　　研究者首先分析了傳統(tǒng)的基于空間變化的全變分(total variation)以及海森(Hessian)正則的缺陷，認為雖然其提取的連續(xù)性特征部分符合熒光成像的特點，但其也會混淆熒光信號與背景邊緣，并且難以從極高噪聲中提取信號。根據(jù)熒光成像特異性標記以及生物結(jié)構(gòu)的特點，研究者首次提出兩個基本屬性來區(qū)分熒光信號和噪聲：(1)跨邊緣的高對比度，以及(2)沿邊緣的高連續(xù)性。在數(shù)學(xué)實現(xiàn)上，作者利用多尺度framelet以及curvelet變換來提取熒光信號中的這兩個關(guān)鍵特征，稱為MRA正則化方法。

　　在分辨率提升機制方面，研究者首先通過模擬實驗證明了Richardson-Lucy迭代由于其統(tǒng)計估計特性會自發(fā)產(chǎn)生偽影?；谖锢砟Ｐ偷牡鏋V波雖然可以在無噪聲情況下完美復(fù)原模糊圖像，但其高頻細節(jié)恢復(fù)需要大量迭代次數(shù)，容易被噪聲淹沒且與基于空間變化的噪聲控制正則相容較差。而研究者所提出的MRA正則化方法由于提供了更精確的熒光噪聲模型，可以有效控制逆濾波迭代中的噪聲并保留其推斷的高頻細節(jié)。研究者進一步提出了一種加速FISTA迭代的策略，可以在短計算時間內(nèi)完成上千次約束逆濾波迭代來恢復(fù)高頻細節(jié)。

　　通過多種成像條件的高低信噪比對圖像恢復(fù)實驗，研究者驗證了MRA正則化方法相較基于空間變化的正則方法可以將信噪比進一步提高2—10dB。

　　圖1. MRA反卷積實現(xiàn)更優(yōu)的噪聲控制和保真分辨率提升。a. 利用SIM高低信噪比對MRA 噪聲控制的驗證； b. MRA與Hessian正則在連續(xù)幀圖像處理中的對比； c. U2OS細胞線粒體的寬敞圖像、Huygens、Sparse以及MRA解卷積結(jié)果和作為真值參考的SR-SIM結(jié)果； d. 從開源BioSR數(shù)據(jù)集中獲得的線性非線性SIM圖像對，非線性SIM作為Huygens、Sparse以及MRA對線性SIM解卷積結(jié)果的比對真值；e. 沿d中兩個白色箭頭指示的線的強度分布

　　研究者利用寬場-SIM、線性SIM-非線性SIM、Confocal-SoRa以及Confocal-STED多種高低分辨率數(shù)據(jù)對，驗證了MRA反卷積相較以Richardson-Lucy為分辨率提升機制的反卷積算法具有顯著優(yōu)越的保真性，解析的高頻細節(jié)結(jié)構(gòu)與超分辨顯微鏡幾乎一致。

　　研究者進一步提出了層切多分辨率分析反卷積算法(SecMRA)，引入了全新設(shè)計的偏置稀疏正則，該方法可以有效地提高在強背景圖像處理中的表現(xiàn)。SecMRA反卷積后的寬場圖像可以達到類似共聚焦顯微鏡的層切效果，可以在提供高質(zhì)量圖像的同時進一步降低活細胞成像的光毒性。作者在寬場、Lightsheet、Confocal、SoRa、SIM、STED和Expansion顯微鏡等多種成像模態(tài)中驗證了該方法的有效性。

　　研究者展示了利用MRA反卷積算法來支持低光照低毒性熒光成像以研究細胞活動的實例。利用MRA反卷積，研究者實現(xiàn)了對微管和溶酶體共標的長時程超分辨成像，觀察到了溶酶體運動與微管結(jié)構(gòu)的緊密聯(lián)系。作者還利用寬場顯微鏡實現(xiàn)了細胞核周半小時以上的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共標成像，觀察到了線粒體迅速延伸后收縮最后綁定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的現(xiàn)象。

　　為了推廣該技術(shù)，研究者還提出了解決正則反卷積算法中超參數(shù)調(diào)整的方案，通過用曲線波系數(shù)稀疏度來估計噪聲強度，實現(xiàn)了參數(shù)自動確定。研究者編寫了用戶友好的GUI軟件，并且開源了所有代碼以及熒光圖像原始數(shù)據(jù)，以便于用戶和開發(fā)者使用。研究者希望該工作可以為便于生物學(xué)家和顯微學(xué)家可以一手使用的反卷積工具。

　　圖2. SecMRA反卷積助力長時程活細胞成像。a、b. 微管溶酶體雙色成像，SecMRA反卷積有效去除圖像中的噪聲、離焦背景并提高分辨率；c—g. SecMRA反卷積實現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體互作成像

　　北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院博士生侯宜偉為論文的第一作者。席鵬、北大李美琪博士為該論文的共同通信作者。論文主要貢獻者還包括北京大學(xué)博士生付允哲以及北京艾銳精儀公司工程師王文熠、蓋希川。該研究工作得到了國家自然科學(xué)基金區(qū)域聯(lián)合重點項目、面上項目等的大力支持。

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