包納米蟲(Bona)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書
 

　　產(chǎn)品僅用于科研產(chǎn)品名稱:包納米蟲(Bona)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)
 

　　規(guī)格:48T 0.1PCR管/48T 0.2PCR管
 

　　技術(shù)服務(wù)內(nèi)容：
 

　　實驗步驟包括RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR和瓊脂糖凝膠電泳，以軟件分析電泳條帶的灰度值(IOD值)，通過與內(nèi)參基因的灰度值比較，判斷目的mRNA的相對表達(dá)量。
 

　　使用方法:
 

　　一、樣品 RNA 的制備
 

　　1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意：可以選用本公司生產(chǎn)的一管式病毒 RNAout
 

　　2、或柱式病毒 RNAout。
 

　　二：包納米蟲（Bona）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書RT(逆轉(zhuǎn)錄)反應(yīng)合成 cDNA
 

　　1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系(20 μL 體系)
 

　　2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。
 

　　3. 嚴(yán)格按順序加入 6μL RT Buffer(含 dNTP)和 2μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(含 RI)，
 

　　反應(yīng)終體積為 20μL。
 

　　4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。
 

　　5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，丌需要純化。
 

　　三、操作方法
 

　　1樣本的處理(在樣本制備區(qū)進(jìn)行)：
 

　　1.1、取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和(陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出)，做標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)
 

　　1.2、每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L，一份樣本換用一個吸頭，再加入 200 ?L 氯仿，混勻器上振蕩混勻 5 s(不能過于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻)，于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。
 

　　1.3、取與1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 ?L 異丙醇(-20℃預(yù)冷)， 做標(biāo)記。吸取1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取 500?L，不能吸出中間層，顛倒混勻。
 

　　1.4、于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min(Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 ?L 75% 乙醇，顛倒洗滌。1.5、于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min(Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)。
 

　　1.6、4 000 r/min 離心 10s(Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)，將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。
 

　　1.7、加入 11 ?L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)溆?。提取?RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。
 

　　【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》(貨號：HB-QPCR-01)使用，更方便快捷提取核酸】。
 

　　注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)
 

　　包納米蟲（Bona）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書實驗注意事項：
 

　　1)RT-PCR可以檢測組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認(rèn)實驗方案和樣本情況；
 

　　2)客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號；
 

　　3)客戶盡量不要提DNA或RNA樣品。
 

　　4)樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，*通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計的引物來指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量(包括*定量和相對定量)和定性分析。
 

　　主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。
 

　　主要技術(shù)：引物設(shè)計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。