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ACK紅細(xì)胞裂解液(ACK Lysis Buffer)操作步驟

時(shí)間:2018-8-7閱讀:891
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【操作步驟】

A、組織細(xì)胞樣本的常規(guī)操作

1、制備細(xì)胞懸液: 新鮮組織經(jīng)過*或膠原酶等消化處理,通過適當(dāng)方法制備成細(xì)胞懸液,離心棄上清。

2、裂解:加入3~5倍細(xì)胞沉淀體積的ACK Lysis Buffer,輕柔吹打混勻,裂解1~2min。本操作步驟在4℃條件下操作更佳,亦可在室溫下操作。

3、離心:4℃,400~500g離心5min,棄紅色上清。如無低溫離心機(jī)本步驟亦可在室溫下操作。

4、如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*,可以重復(fù)上述步驟2和步驟3各一次。

5、洗滌:根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液,輕柔混勻重懸沉淀。4℃,400~500g離心2~3min,棄上清,離心步驟亦可在室溫下操作。所加入的PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液的量一般應(yīng)大于細(xì)胞沉淀體積的5倍以上。

6、如有必要,重復(fù)上述步驟5一次,共洗滌1~2次。

7、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀,進(jìn)行計(jì)數(shù)、培養(yǎng)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

B、組織細(xì)胞樣本的快速操作(無需洗滌)

1、制備細(xì)胞懸液:新鮮組織經(jīng)過*或膠原酶等消化處理,通過適當(dāng)方法制備成細(xì)胞懸液,離心棄上清。

2、裂解:加入細(xì)胞5倍細(xì)胞沉淀體積的ACK Lysis Buffer,輕柔吹打混勻,裂解1~2min。本操作步驟在4℃條件下操作更佳,亦可在室溫下操作。

3、加入15~20ml的 PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液,輕柔混勻。

4、離心:4℃,400~500g離心5min,棄紅色上清,本步驟亦可在室溫下操作。

5、如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*,可以重復(fù)上述步驟2~4各一次。

6、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀,進(jìn)行計(jì)數(shù)、培養(yǎng)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

C、血液樣本的常規(guī)操作

1、取新鮮抗凝血,400~500g離心5min,離心棄上清。

2、裂解: 加入6~10倍細(xì)胞沉淀體積的ACK Lysis Buffer,輕柔吹打混勻,裂解1~5min。本操作步驟在4℃條件下操作更佳,亦可在室溫下操作。(特別提醒:對(duì)于鼠的血液,裂解1~2min已經(jīng)足夠,對(duì)于人的外周血,宜延長裂解時(shí)間至4~5min,并且裂解過程中輕輕搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解)

3、離心:4℃,400~500g離心5min,棄紅色上清。如無低溫離心機(jī)本步驟亦可在室溫下操作。

4、如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*,可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。

5、洗滌:根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液,輕柔混勻重懸沉淀。4℃,400~500g離心2~3min,棄上清,離心步驟亦可在室溫下操作。所加入的PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液的量一般應(yīng)大于細(xì)胞沉淀體積的5倍以上。

6、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀,進(jìn)行計(jì)數(shù)、培養(yǎng)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注意: 對(duì)于微量或少量的血液樣本,可以不用第1步操作,加入10倍血液體積的ACK Lysis Buffer進(jìn)行第2步操作,并在4℃或室溫裂解4~15min。對(duì)于鼠的血液,裂解4~5min已經(jīng)足夠;對(duì)于人的外周血,宜延長裂解時(shí)間至10min,但通常不宜超過15min,并且裂解過程中宜適當(dāng)搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。

D、血液樣本的快速操作(無需洗滌)

1、新鮮抗凝血中加入10倍體積的ACK Lysis Buffer,輕輕吹打混勻,裂解4~15min。本操作步驟在4℃條件下操作更佳,亦可在室溫下操作。(特別提醒:對(duì)于鼠的血液,裂解4~5min已經(jīng)足夠,對(duì)于人的外周血,宜延長裂解時(shí)間至10min,但通常不宜超過15min,并且裂解過程中宜適當(dāng)搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。

2、加入20~30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液,輕柔混勻。

3、400~500g離心5min,棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

4、如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*,可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。

5、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀,進(jìn)行計(jì)數(shù)、培養(yǎng)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
 

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