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　　一、試驗?zāi)康摹?br /> 

　　1、掌握無菌操作技術(shù)。
 

　　2、掌握原代和傳代細胞培養(yǎng)。
 

　　3、掌握細胞冷凍和復(fù)蘇技術(shù)。
 

　　4、了解培養(yǎng)成纖維細胞的形態(tài)。
 

　　二、試驗原理。
 

　　將動物機體的組織從機體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。
 

　　細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代(再培養(yǎng))。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
 

　　對具有移動特性的穩(wěn)定細胞系或細胞株進行長期保存，一方面可以作為細胞研究的試驗材料，另一方面可以做細胞制品的生產(chǎn)材料。目前廣泛應(yīng)用的細胞保存方法是低溫冷凍保存法，。細胞的冷凍保存的原則是慢凍快融，這樣做是為了防止細胞由于冷凍過程中產(chǎn)生了冰晶而發(fā)生細胞破裂。
 

　　三、實驗器材及藥品。
 

　　器材：懷孕的小白鼠、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液器、眼科剪、鑷子、酒精燈、離心機、水浴鍋、倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、離心管、高壓滅菌鍋、試管架等。
 

　　藥品：小牛血清、DMEM合成培養(yǎng)基、抗生素、DMSO冷凍劑、胰酶、PBS緩
 

　　沖液等。
 

　　四、實驗操作。
 

　　1、消毒滅菌。
 

　　將實驗所需用到的工具(如槍頭、培養(yǎng)皿、眼科剪、鑷子以及每個人的實驗服等)集中滅菌、烘干。配制75%的酒精以備實驗時所需。
 

　　2、培養(yǎng)基的配制。
 

　　分別取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培養(yǎng)基，將兩種培養(yǎng)基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混勻就得到了細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液。 3、原代培養(yǎng)。
 

　　(1)、準備。將實驗過程中會用到的工具以及藥品全部放在超凈工作臺上進行紫外消毒滅菌。實驗開始前帶好乳膠手套，用酒精對手進行消毒。將懷孕的小白鼠放在酒精中殺死，取出子宮內(nèi)的胚胎組織。
 

　　(2)、剪切與消化。將胚胎組織放于平板中，用眼科剪將組織塊剪碎，剪得越碎越好。將剪碎的組織塊放于離心管中，加入大約200µl的胰酶進行消化。也可將其置于37度恒溫箱中進行消化。
 

　　(3)、分離細胞。消化到一定時間時，如果離心管中的溶液中出現(xiàn)了明顯的渾濁，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，則應(yīng)該加入與胰酶等量的培養(yǎng)液終止消化。離心管于離心機中離心，棄上清液，得到分散的細胞。
 

　　(4)、轉(zhuǎn)移細胞并培養(yǎng)。向含有分散細胞的離心管中加入配制好的培養(yǎng)液，吹打混勻，將培養(yǎng)液用移液器移到細胞培養(yǎng)瓶中。置于36.5℃恒溫CO2箱培養(yǎng)，瓶口少少擰的松一點。 4、傳代培養(yǎng)。
 

　　(1)、倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)。倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的長勢及密度，根據(jù)細胞密度決定傳代的稀釋倍數(shù)。
 

　　(2)、收集原代培養(yǎng)的細胞。吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，并用PBS沖洗兩遍。然后向培養(yǎng)瓶中加入200µl的胰酶進行消化。消化一段時間后用配置好的培養(yǎng)液等比例終止消化。然后離心，收集到原代培養(yǎng)的細胞。
 

　　(3)、傳代細胞的培養(yǎng)。向離心管內(nèi)加入大約7—8ml的培養(yǎng)液，吹打混勻。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，置于37度恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)1—2天后于顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)。
 

　　5、細胞冷凍保存。
 

　　(1)、收集細胞。吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，并用PBS沖洗兩遍。然后向培養(yǎng)瓶中加入200µl的胰酶進行消化。消化一段時間后用配置好的培養(yǎng)液等比例終止消化。然后離心，收集細胞。
 

　　(2)、冷凍。向離心管中加入一定量的培養(yǎng)液以及10%—20%的DMSO冷凍液，吹打混勻并轉(zhuǎn)移到冷凍管中。先將冷凍管在4度冰箱中放置10min，再放在—70度的冰箱中冷凍過夜。
 

　　(3)、復(fù)蘇。將冷凍的細胞取出來后，立刻放在40度水浴中，使其快速融化。并對融化的細胞 進行進一步的觀察。
 

　　五、實驗分析與討論。
 

　　從本次實驗的圖片可以看出來，實驗做得還算成功，細胞基本上沒有被污染。在做的過程中一定要非常注意無菌操作，這是決定試驗成功的關(guān)鍵因素。在做原代培養(yǎng)的時候，一定要將小鼠胚胎的組織塊剪得夠碎，確保在用胰酶消化后可以得到分離的單個細胞。在做傳代培養(yǎng)時，要把握好胰酶的消化時間。冷凍復(fù)蘇時，一定要按照步驟進行冷凍，遵循慢凍速溶的原則。