在傳統(tǒng)的軟瓊脂克隆形成試驗中，細胞生長在上層含有細胞培養(yǎng)基的軟瓊脂中，下層軟瓊脂也與細胞培養(yǎng)基混合，但含有較高濃度的瓊脂。這可以防止細胞貼附在培養(yǎng)板上，還可以使轉化細胞形成可見的菌落。這種技術的原理是正常細胞依靠細胞與細胞外基質的接觸才能生長和分裂，相反，不管周圍環(huán)境如何，轉化細胞均具有生長和分化的能力，因此能夠以錨定獨立的方式形成菌落的細胞被認為是轉化和致癌的。
實驗操作：
準備材料和試劑：
1、配制2×培養(yǎng)基：1 g培養(yǎng)基粉末，0.2 g碳酸氫鈉，加入去離子水，定容到50 mL。
2、將培養(yǎng)基經(jīng)0.2 μm濾膜過濾除菌。
3、加入目標細胞所需培養(yǎng)基的其他成分。例如：用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CMT 167細胞需要加入10% FBS，1% 青霉素/鏈霉素。使用之前將培養(yǎng)基放在37°C恒溫水浴鍋中。
4、配制1×培養(yǎng)基，依照目標細胞生長所需培養(yǎng)基配制。
5、配制1%瓊脂：1 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。
6、配制0.6%瓊脂：0.6 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。
7、將配好的瓊脂經(jīng)高溫高壓滅菌，滅菌后可放在4°C保存，使用前加熱至*溶解。
8、配制氯化硝基四氮唑藍試劑：1 mg/mL氯化硝基四氮唑藍加入到1×PBS中。
鋪下膠：
1、將熔化的1%瓊脂溶液和預熱的2×培養(yǎng)基放入裝滿熱水（42°C）的桶（或恒溫水浴鍋）中，在熱水里放一個50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內。
2、6孔板中的每個孔需要加入1.5 mL混合的瓊脂和培養(yǎng)基，為保證足夠的量，一個6孔板準備12 mL。
3、首先加入6 mL的培養(yǎng)液到50 mL的錐形管，再加入6 mL的1%瓊脂溶液。將錐形管多次翻轉混勻，每個孔中迅速加入1.5 mL混合液，加混合液時不能產(chǎn)生氣泡。
4、室溫靜置30 min，待下膠凝固。
鋪上膠：
1、收獲的細胞用胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)基以1:5的比例稀釋（如1 mL胰蛋白酶，加4 mL培養(yǎng)基），放入15 mL錐形管。
2、細胞計數(shù)：以每孔5000個細胞作為起始，并根據(jù)需要進行調整。
3、細胞懸浮液的體積需要1.5 mL。一個6孔板準備12 mL細胞懸液。
4、將熔化的0.6%瓊脂溶液放入裝有熱水（42°C）的桶中，在熱水里放一個50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內。
5、以1:1的比例混合0.6%瓊脂溶液和細胞懸液，吸取6 mL細胞懸浮液到50 mL錐形管，再加入6 mL的0.6%瓊脂溶液?；靹蚝笱杆偌尤?孔板中，每孔1.5 ml。小心避免產(chǎn)生氣泡。
6、室溫靜置30 min，待上膠凝固后放入細胞培養(yǎng)箱。
7、足夠的菌落形成所需的時間因每個細胞系而異，通常為21天左右。每星期加兩次100 g的培養(yǎng)基以防止干燥。
7
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務